Kryoelektronimikroskopia

Mihin Kryo-EM-menetelmää käytetään?

Kryo-EM-tekniikkaa käytetään suurten molekyylien kuvantamiseen erityisesti tilanteissa, joissa NMR- ja XRD-menetelmiä ei voida näytetyypin monimutkaisuuden vuoksi käyttää. Kryo-EM hyödyntää useista eri kuvakulmista otettuja 2D kuvia ja tietokoneohjelmistoa 3D-mallien muodostamiseen biologisista näytetyypeistä, kuten proteiineista, viruksista, entsyymeistä ja bakteereista. Menetelmää hyödynnetään niin biologisessa kuin lääketieteellisessä tutkimuksessa.

Miten kryogeeninen elektronimikroskopia toimii?

Kryo-EM:n aluksi näyte pikajäädytetään nestemäisellä etanolilla, joka mahdollistaa nestemäistä typpeä nopeamman jäähdytyksen. Prosessin nopeuden ansiosta kuvantamista häiritseviä jääkiteitä ei pääse muodostumaan. Molekyylit myös säilyvät luonnollisessa muodossaan, eikä niitä tarvitse kiteyttää, kuten röntgenkristallografiassa. Jäädytyksen jälkeen molekyyli kuvannetaan elektronimikroskoopilla.

Vaikka termi kryo-EM viittaa kryogeeniseen elektronimikroskopiaan yleisellä tasolla, tarkoitetaan sillä lähes aina kryo-TEM-menetelmää eli pikajäädytyksen ja läpäisyelektronimikroskopian yhdistelmää. Kryo-SEM on myös mahdollista, mutta verrattain harvinaista.

Sopivat näytteet ja näytteiden valmistelu

Kryo-EM-tekniikalla voidaan analysoida monenlaisia ​​molekyylejä, kunhan ne ovat pikajäädytykseen soveltuvissa liuoksissa. Molekyylikoon tulee myös olla suhteellisen suuri, yleensä yli 150 kDa (halkaisijaltaan noin 5–300 nm). Biologisten näytteiden lisäksi menetelmällä voidaan analysoida huoneenlämmössä helposti haihtuvia aineita, kuten rikkiä, jota olisi muuten vaikea karakterisoida elektronimikroskoopilla.

Kryo-TEM vs. TEM

Perinteinen läpäisyelektronimikroskopia eli TEM suoritetaan tyhjiössä, jotta ilman epäpuhtaudet eivät vaikuttaisi tuloksiin tai elektronisäteen toimintaan. Useimmissa tapauksissa tämä ei aiheuta ongelmia, mutta jotkin näytetyypit, kuten haihtuvat aineet ja herkät biomolekyylit, eivät ole stabiileja tyhjiössä tai vaurioituvat helposti korkeaenergisen elektronisuihkun vaikutuksesta. Näissä tilanteissa Kryo-TEM tarjoaa toimivamman ratkaisun.

Kryo-EM vs. NMR

Ydinmagneettista resonanssispektroskopiaa eli NMR:ää käytetään yleisesti rakennemäärityksiin biologisessa ja kemiallisessa analyysissä. NMR sopii erinomaisesti pienten molekyylien rakennemäärityksiin, mutta muuttuu huomattavasti vaikeammaksi molekyylikoon kasvaessa. Kryo-EM-analyysi puolestaan soveltuu erityisesti suurille makromolekyyleille.