HPLC-MS-Analyse

HPLC-Massenspektrometrie als analytisches Werkzeug

Die hochleistungs-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS) ist ein ideales Werkzeug für die Identifizierung, Quantifizierung und Massenanalyse von Komponenten und wird häufig zur Bestimmung der chemischen Zusammensetzung und Reinheit von Chemikalien eingesetzt. Die HPLC-MS weist eine hohe Empfindlichkeit auf und eignet sich optimal für die Durchführung präziser und reproduzierbarer quantitativer Analysen. Die Methode ist ideal für den Nachweis hitzeempfindlicher Verbindungen wie Proteine und Vitamine in Lebensmitteln. Lebensmittelkontaminanten werden ebenfalls häufig mittels HPLC-MS quantifiziert.

Das Funktionsprinzip

Bei der HPLC-MS werden die beiden Techniken (HPLC und MS) durch eine Schnittstelle verbunden, die die getrennten Komponenten aus der Flüssigkeitschromatograph-Säule in die Ionenquelle des Massenspektrometers überführt. Eine Schnittstelle ist erforderlich, da die HPLC bei hohem Druck arbeitet und das MS-System ein Hochvakuum aufweist.

Die HPLC umfasst eine mobile Phase und eine stationäre Phase, die beide an die Probenmatrix und die zu bestimmenden gewünschten Eigenschaften angepasst werden können. Üblicherweise wird die mobile Phase an die Probe angepasst, und die stationäre Phase wird so eingestellt, dass sie gut mit der mobilen Phase zusammenarbeitet. Der Grad der Verbindungstrennung basiert auf der Affinität der Verbindung zur mobilen Phase.

HPLC-Methoden lassen sich anhand der Eigenschaften der stationären und mobilen Phasen in zwei Hauptkategorien einteilen. Eine Kombination aus einer polaren stationären Phase und einer nichtpolaren mobilen Phase wird als „Normalphasenchromatographie” bezeichnet, während das Gegenteil davon, also die Kombination aus einer nichtpolaren stationären und einer polaren mobilen Phase, als „Umkehrphasenchromatographie” bezeichnet wird.

Normalphasen-HPLC

Bei der Normalphasen-HPLC ist die Säule üblicherweise mit Silicapartikeln gefüllt. Das Silica ist polar und bindet an polare Moleküle in der mobilen Phase. Dies bedeutet, dass die am wenigsten polaren Verbindungen zuerst und die polarsten Verbindungen zuletzt eluieren. Die Normalphasen-HPLC eignet sich für stark hydrophobe oder hydrophile Verbindungen, Verbindungen, die nicht in Wasser löslich sind, und Verbindungen, die in Wasser zersetzt werden können. Die ideale Anwendung der Normalphasen-HPLC ist die Trennung von Isomeren.

Umkehrphasen-HPLC

Bei der Umkehrphasen-HPLC besteht die stationäre Phase üblicherweise aus C8- oder C18-Silica (Silica, das mit Alkylketten derivatisiert wurde). Im Gegensatz zur Normalphasen-HPLC eluieren bei der Umkehrphasen-HPLC die polarsten Verbindungen zuerst und die am wenigsten polaren Verbindungen zuletzt. Die stationäre Phase kann aus verschiedenen Feststoffen zusammengesetzt sein, um unterschiedlichen Anforderungen gerecht zu werden.

Kombination von HPLC mit Massenspektrometrie

Nachdem Verbindungen mittels HPLC getrennt wurden, werden sie durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert und ihre Gehalte bestimmt, wobei ein Massenspektrum erzeugt wird, das für jede Verbindung einzigartig ist. In der Massenspektrometrie werden die Verbindungen und ihre Fragmente entweder durch Elektronen- oder chemische Ionisation ionisiert. Die Probe wird dann durch einen Massenanalysator beschleunigt, der entweder ein Quadrupol oder eine Ionenfalle umfasst, und die Ionen werden anhand ihrer Masse-zu-Ladung-Verhältnisse (m/z) identifiziert.

Es ist auch möglich, HPLC mit anderen Detektoren als dem Massenspektrometer zu kombinieren. Bei der HPLC-DAD-Analyse wird beispielsweise stattdessen ein Diodenarraydetektor verwendet. Die Wahl des am besten geeigneten Detektors hängt vom Analyten und dem Ziel der Analyse ab. Im Allgemeinen eignet sich HPLC-MS besser zur Identifizierung unbekannter Komponenten, während der DAD-Detektor gut zur Quantifizierung bekannter Komponenten geeignet ist. Für bestimmte Analyten mit fluoreszierenden Eigenschaften kann die HPLC-FLD-Methode (mit einem Fluoreszenzdetektor) ausgezeichnete Ergebnisse liefern.

Proben und Probenvorbereitung

HPLC-MS ist für Proben in flüssiger Form geeignet. Bei festen Probenmatrices ist eine Probenvorbereitung erforderlich. Die zu bestimmenden Verbindungen müssen vor der Analyse in ein Lösungsmittel extrahiert und filtriert werden.

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